轉染試劑是一種試劑 轉染試劑是一種適合于把質粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白復合物轉染到培養(yǎng)的真核細胞中的陽離子脂質體轉染試劑。
轉染試劑優(yōu)點
1、轉染效率高，重復性好，操作簡單。
2、無明顯細胞毒性，用 轉染細胞后，大多數(shù)細胞72小時內(nèi)不更換培養(yǎng)液無明顯細胞毒性。
3、 轉染試劑對于貼壁細胞和懸浮細胞都適用，并且可以用于穩(wěn)定表達細胞株的篩選。
使用說明
1. 細胞培養(yǎng)：以293T細胞為例，轉染前一天(20-24小時) ~0.4×106 細胞(具體的細胞數(shù)量據(jù)細胞大小和細胞生長速度而定)鋪到六孔板內(nèi)，使第二天細胞匯合度（confluent）能達到約50%~70%。
2. 在進行下述轉染步驟前，把六孔板每孔內(nèi)換成新鮮細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)液的體積約為2 ml。
注：其他培養(yǎng)介質培養(yǎng)液體積參見《各種培養(yǎng)介質下 轉染DNA詳表》，抗生素、Glutamine等對 轉染并無影響。如果LipoFiter對目的細胞毒性較大，轉染試劑建議去除轉染體系內(nèi)的抗生素。
3. 把 脂質體轉染試劑輕輕混勻。
4.對于待轉染的六孔板中一個孔的細胞，取一只潔凈無菌離心管，加入4 mg質粒DNA（其他培養(yǎng)介質DNA用量參見附表）到250 ml DMEM溶液，用槍輕輕吹打混勻。
5. 取另一只潔凈無菌離心管，加入250 ml DMEM溶液，再加入10 ml （其他培養(yǎng)介質 用量參見附表），用槍輕輕吹打混勻,室溫放置5分鐘。
6. 將步驟4與5中的DNA溶液與 溶液混合，用槍輕輕吹打混勻。注意：不可Vortex或離心。
7. 室溫孵育20分鐘。有可能出現(xiàn)絮狀沉淀物，屬正常現(xiàn)象，不會影響轉染效率。
8. 轉染試劑無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，均把500 ml -DNA混合物全部加入六孔板的一個孔內(nèi)。加入時注意盡量均勻加入到整個孔內(nèi)，隨后輕輕“8”字搖擺混勻。
注：針對貼壁細胞，如上述所說，只需將 -DNA復合物加入細胞中孵育6小時再換液即可。若是轉染懸浮或半懸浮細胞，則推薦通過平角離心轉染法，即將適量的 -DNA復合物加入細胞培養(yǎng)皿后（步驟8），封口膜封好，放入平角離心機，低速（200 g）離心1.5 小時，然后放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6小時再換液即可。
9. 細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-12小時后，去除含有 -DNA的無血清培養(yǎng)液。每孔加入2 ml新鮮含血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
注：通常 -DNA混合物和細胞一起孵育6小時已經(jīng)足夠產(chǎn)生較高的轉染效率。轉染試劑大多數(shù)細胞和 -DNA一起培養(yǎng)長達72小時未見明顯細胞毒性。但轉染后6小時更換新鮮培養(yǎng)液對于一些生長非常快速的細胞有助于提高轉染效率。對一些比較易于轉染的細胞如HEK-293T細胞，換液可視細胞生長狀況而定，無需為提高轉染效率而換液。
10. 轉染后續(xù)處理：
1) 對于基因表達，再培養(yǎng)24-40小時后即可檢測轉染效果，如轉染帶GFP或者其他熒光基因的表達載體，可用熒光顯微鏡觀測細胞轉染效率。
2) 轉染試劑用于篩選穩(wěn)定表達細胞株，則在轉染后24小時即可加入適當?shù)暮Y選藥物，例如G418或Puromycin（嘌呤霉素）等，進行穩(wěn)定表達細胞株的篩選。
